Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（绿光FITC+红光PI）
货号：108710 编号：XFBM1046
CAS号： 规格：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（绿光FITC+红光PI）
包装：50 T 保质期：90天
保存条件：4℃冷藏保存
产品描述
细胞凋亡是发生在胚胎发育和维持组织稳态过程中的正常生理过程，伴随着许多形态学特征改变，其中细胞膜的丢失是细胞凋亡早期的特征之一。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)只分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧，但在细胞凋亡早期，PS会从脂膜的内侧翻转外侧，使其暴露于细胞外侧。Annexin V（膜联蛋白V）是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，会与暴露PS的细胞特异性结合，因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的指标之一。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过具有完整细胞膜的正常细胞和早期凋亡细胞，但能透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜并将细胞核染色。
本产品通过将Annexin V用FITC进行标记后作为检测探针，检测细胞的早期凋亡。同时以PI区分存活的细胞与坏死、晚期凋亡细胞。Annexin V-FITC和PI结合使用，活细胞呈现阴性染色（Annexin V-/PI-），早期凋亡细胞呈现单荧光阳性（Annexin V+/PI-），而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现双荧光阳性（Annexin V+/PI+）。本试剂盒适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；2-8℃避光保存，12个月有效。
组成
ComponentXFBM1046-50TXFBM1046-100T
Annexin V-FITC250 μL2×250 μL
Propidium Iodide（PI）250 μL2×250 μL
1×Binding Buffer25 mL2×25 mL
操作步骤
1. 悬浮细胞：取细胞悬液，经500 g，4℃离心5 min收集细胞；
贴壁细胞：先收集细胞培养上清液。然后用不含EDTA的胰酶（推荐XFBM988或XFBM992）消化后，与细胞培养上清液合并，经500 g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以免过度消化引起假阳性。
2. 用预冷的PBS（推荐XFBM963）清洗细胞2次，每次500 g、4℃离心5 min收集细胞；
3. 用预冷的1×Binding Buffer轻柔重悬细胞，调整细胞浓度至1~5×106/mL；
4. 取100 μL细胞悬液，加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI，轻柔混匀，室温避光8-10 min；
5. 加入400 µL预冷的1×Binding Buffer，轻轻摇匀，1 h内用流式细胞仪或者荧光显微镜进行检测。
结果分析
1. 流式细胞仪检测
a. 流式细胞仪检测分析时选择合适的电压并调好光补偿，除实验组外建议设置阴性对照（不加任何标记物）用于调节电压，单标对照（只加Annexin V-FITC，以及只加PI的细胞）用于调节补偿；；
b. 流式细胞仪检测分析参考实例：
用5 µM Camptothecin诱导Jurkat T淋巴瘤细胞6 h，参照以上实验步骤，用流式细胞仪进行检测，结果如下图所示。
FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长为525 nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm。经流式细胞仪相关分析软件绘制双色散点图，FITC位于横坐标，PI位于纵坐标。在典型实验中，活细胞无荧光，散点位于左下第一象限。处于早期凋亡细胞有较强的绿色荧光，散点位于右下第二象限。晚期凋亡细胞、坏死细胞呈现红色、绿色双重荧光，散点位于右上第三象限。
2. 荧光显微镜检测
在载玻片上加5-10 µL经Annexin V-FITC和PI双染的细胞悬液，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用双色滤光片进行观察，Annexin V-FITC呈绿色荧光信号，PI呈红色荧光信号。【用荧光显微镜拍照时建议加入适量抗荧光淬灭封片剂（XFBM1086）以防止出现荧光淬灭问题】
注意事项
1. 整个实验过程操作应尽量轻柔避免细胞破碎，影响实验结果。
2. 用PBS清洗细胞不可省略，同时也要尽可能的去掉残留的PBS。
3. 使用胰酶消化细胞时，应小心操作，避免人为损伤细胞，并控制消化时间。消化时间过短，细胞需用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的机械损伤；若消化时间过长，细胞膜同样容易受到损伤。影响检测结果。另外不能使用含EDTA的胰酶，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
4. 贴壁细胞经凋亡刺激后，如有部分细胞漂浮，需同时收集细胞培养上清液及贴壁细胞合并染色，会使得结果更加准确。
5. Annexin V-FITC和PI对光敏感，操作时注意避光。反应结束后应尽快进行检测。
6. 实验过程中请穿实验服并戴一次性手套，避免污染，确保安全。
本产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
（产品包装升级中，以实物为准。）
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