Caspase-9活性检测试剂盒（比色法）
货号：108694 编号：XFBM1031
CAS号： 规格：Caspase-9活性检测试剂盒（比色法）
包装：50 T 保质期：90天
保存条件：4℃冷藏保存
产品简介
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)，是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-9也称ICE-LAP6或Mch6，是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个Caspase。线粒体释放细胞色素c以后，Caspase-9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的Caspase-9可以激活细胞凋亡的最关键酶Caspase-3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase-9的激活可以通过磷酸化进行调控。
Caspase-9活性检测试剂盒（比色法），基于活化的Caspase-9可以催化底物Ac-LEHD-pNA (acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase-9的活性。pNA在405 nm附近有强吸收。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，Ac-LEHD-pNA和pNA标准品需避光保存；12个月有效。
组成
ComponentXFBM1031-50T
裂解液10 mL
检测缓冲液3 mL
Ac-LEHD-pNA ( 5 mM )300 μL
pNA标准品 ( 10 mM )100 μL
操作步骤
1. 样品准备：
1.1. 组织样品：按照每10~50 mg组织加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，在冰上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5 mL离心管中，冰浴继续裂解5-10分钟。4℃，10000 g离心10-15 分钟，取上清置于冰上待测。留取部分上清用于蛋白浓度（Bradford法，XFBM1061）测定。
1.2. 细胞样品：收集细胞，用PBS清洗一次，大约每200万个细胞加50 μL裂解液，吹散后，冰浴裂解30分钟，每10分钟震荡30秒，4℃，10000 g离心10-15 分钟，取上清置于冰上待测。留取部分上清用于蛋白浓度（Bradford法，XFBM1061）测定。
2. Caspase-9活性的检测
2.1. 按照下列反应体系添加试剂：样本空白
待测样本45 μL
裂解液45 μL
检测缓冲液50 μL50 μL
Ac-LEHD-pNA(5mM)5 μL5 μL
注：尽量保证样本的细胞数一致或者蛋白浓度一致。对于样品中Caspase酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定；组织样本如本底颜色深，需要做样本对照（不添加底物）。
2.2. 加入Ac-LEHD-pNA后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
2.3. 用酶标仪检测样品405 nm处吸光值，扣除空白对照的吸光值，即为样品中Caspase-9催化产生的pNA产生的吸光值（ΔA405）。
2.4. 通过计算OD诱导组/OD阴性对照组的倍数，来确定凋亡诱导组Caspase-9活化的程度。或者通过标准曲线计算酶活力单位。
3. 标准曲线制作（可选）
3.1. 标准品稀释液的配制：pNA标准品 (10 mM)使用PBS缓冲液或生理盐水稀释50倍后为200 μmol/L，然后2倍逐级稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 μmol/L，作为标准品。
3.2. 每个浓度取100 μL用酶标仪检测405 nm处吸光度（A405）。
3.3. 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线y=ax+b。
3.4. 酶活定义：当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1 nmol Ac-LEHD-pNA产生1 nmol pNA所需Caspase-9酶量定义为一个酶活单位。
3.5. 酶活计算：
Activity, U/mg=（ΔA405-b）/a*D/T/Cpr
注：D为样本稀释倍数；T为检测时间，单位小时（H）；Cpr为样本加入检测体系前的浓度，单位mg/mL
注意事项
1. pNA标准品 (10 mM)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
2. 收集细胞沉淀后立即检测或者-80℃保存备用，尽快检测避免蛋白酶降解导致检测失败。
3. 使用Bradford法（XFBM1061）测定蛋白浓度。建议样品用水稀释1倍后再用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。
4. Caspase活性检测试剂盒（比色法），其相关系列产品（XFBM1028、XFBM1029、XFBM1030、XFBM1031），裂解液可通用。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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