试剂组成： 

操作步骤：

1 、试剂制备

PicaGreen dsDNA  （ Component A   ）(定量试剂是以 1mL   的浓缩液形式保存在无水的 DMSO    （ 二甲基亚砜）中。实验当天，配制 2XPicoGreen  试剂的操作溶液，用 1xTE（Component B） 按 1:200   的比例稀释浓缩液。如果要准备足够的操作溶液测定 20  个样品， 可在 20mL1x TE   （ Component B） 中加入 100 μ LPicaGreen dsDNA（ Component A   ）  定量试剂。由于试剂容   易吸附到玻璃表面， 要在塑料容器中配制。 PicaGreen  试剂（ Component A   ）见光易降解，  所以应将配好的溶液用锡箔包住或放置暗处避光保存。溶液最好在配制好数小时内使用，以  保证最佳结果。

2 、 DNA  标准曲线

2.1  预备 1 μ g/mLdsDNA（  Component  c ）  或贮存液于 1x TE   中。根据在 1cm   光程长度的

比色杯中 A260nm  时的吸光度确定 DNA  浓度； 相应于 1 μ g/mLdsDNA   溶液 A260=0.02。尽  管任何纯化的 dsDNA  制剂都可用来做标准曲线，但常用的是小牛胸腺 DNA。最好用跟被检  测的样品相似的 DNA  做标准曲线，用或长或短的线型 DNA   片段测定相近大小的酶切片段； 质粒用于测定质粒 DNA。然而大部分线状 dsDNA  分子，不管其片段长度大小， 都会产生大  致相等的信号。PicaGreen  试剂测定法在通常污染核酸制剂的几种复合物存在的条件下仍能  保持线状，尽管信号强度可能受到影响。因此，为了得到有效的对照处理，被用来做标准曲  线的 dsDNA  溶液要用和实验样品相同的方式来处理， 并且应该包含相同的可能存在的污染  物。

2.2  要产生从 0.5ng/mL   到 500ng/mL（ 见表 1）单重复 8  个点的标准曲线，在 2X   终浓度下 配制一系列的 DNA  溶液，混合相同体积的 2XDNA  和 2XPicaGreen  操作溶液，放入 10×10mm 比色杯中。混合相同体积的 1XTE  和 2XPicaGreen  操作溶液以备空白对照。避光于室温下放 置 2-5  分钟。  

 表 1  用 10× 10mm   比色杯时 DNA  标准曲线

2.3  当用微量检测皿适配器时， PicaGreen  测定也可在较低的测定体积（ 50 μ L  到 200 μ L） 内完成。欲产生从 1ng/mL  到 100ng/mL（ 见表 2） 的标准曲线，在 2X   终浓度下配制一系列 的 DNA  溶液， 混合相同体积的 2XDNA   和 2XPicaGreen  操作溶液， 将至少 50 μ L   溶液转移 到微量检测皿中。确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部经常可以驱散气 泡。避光于室温下放置 2-5  分钟。

 表 2  用微量检测皿时 DNA   标准曲线

2.4 孵育后用合适的荧光计测量样品荧光值。选择蓝色激发光， 用荧光值最大的样品校正仪 器。

2.5  测量剩余样品的荧光值。不同的微型荧光计将给出一个直接的浓度读数，数据可以用来 产生 DNA  浓度的标准曲线， 下面以 TBS-380  微型荧光计为例。

图 1            PicaGreen  标准曲线

3 、样品分析

3.1  用 1X TE  稀释未知 DNA  样品至需要的体积（ 10×10mm   比色杯需 1.0mL ， 微量检测皿 需 25-100 μ L）。对样品高度稀释可以确保任何污染物都被最大限度地冲淡。然而，也要避免 取样体积太小而无法精确吸取的情况。去除样品中 RNA  和 ssDNA  参照 4  部分。

3.2  在每个样品中加入 2XPicaGreen  试剂的操作溶液（3.1  节准备），混合好，将混合物移入 合适的比色杯，避光于室温下放置 2-5  分钟。

3.3  可以对样品进行不同的稀释处理重复测定以确保结果的准确性。 4  去除样品中单链核苷酸

当 ssDNA  与 dsDNA  等摩尔浓度时，后者的测定受前者的干扰很小。前者浓度 10  倍于后者 时，。对荧光信号的干扰也不过 10% 。但当 DNA  浓度低时， ssDNA   能产生较大干扰在高浓 度时， 由 RNA  结合 PicaGreen  试剂产生的荧光值用 RNA 酶处理样品可消除。RNA   酶 A、酶 T1  结合核酸酶 S1  能除去所有单链核酸， 从而保证样品荧光值是由 dsDNA  产生。（ 具体做 法请查阅相关的参考文献）