货号和规格:

本品含 Taq DNA 聚合酶突变体，dNTP ，Mg2+ ，SYBR Green Ⅰ等。配送 ROX 校正染液，请根据机型向供应商 索取， 使用方法详见本说明书后文<ROX 矫正染液>部 分。

产品说明：

本品基于 SYBR Green Ⅰ染料嵌合荧光法用于定量  PCR（ qPCR） 检测。本产品基于热启动的 Taq DNA  Polymerase ， 高度优化的二价阳离子缓冲液，有效抑制  非特异扩增， 显著提高扩增效率，从而使 qPCR 反应具  有更高灵敏度。本产品中含有 qPCR 反应检测用的最适  浓度 SYBR Green Ⅰ, 是一种 2 ×预混合试剂，操作便捷。 使用本产品进行 qPCR 反应，可对靶基因以及特异 PCR   扩增产物进行准确定量的检测。该产品重复性好，灵敏  度高。产品经严格测试， 无大肠杆菌残留 DNA ，扩增  基线平稳。

试剂盒原理：

本产品利用 Taq DNA Polymerase 进行 PCR ， 通过 检测反应液中 SYBR Green  Ⅰ的荧光强度， 达到监控 PCR 产物扩增量的目的。

通过 PCR 以微量 DNA 作为模板，通过热变性、引  物退火、DNA 聚合酶作用下引物的延伸生成双链 DNA， 并在短时间内扩增 DNA 达百万倍以上。反应液中的  SYBR Green Ⅰ可与双链 DNA 结合发出荧光，通过检测  PCR 反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准

确定量， 同时还可以测定扩增目的 DNA 片段的融解温 度。

操作方法：

1）反应体系配制

按下列组分配制 PCR 反应液

 注意事项：

a.   通常引物终浓度为   0.2-0.4µM 可以得到较好结果。反  应性能较差时，可以在 0.2-1.0µM 范围内调整引物浓度。 b.   在 20µL 反应体系中， DNA 模板的添加量通常在    100ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因  的拷贝数不同，必要时可以进行梯度稀释，确定最佳的    模板添加量。

c.   按照各仪器推荐体系进行反应液的配制。

2）qPCR 反应程序设置

qPCR 通常用两种方法： 两步法和三步法。一般情况下 建议采用下列两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到 良好的实验结果时，再进行   PCR 条件的优化。由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较 差时，可以尝试三步法 PCR 扩增反应。

注： 根据 DNA 模板的特点和 GC 含量等， 可适当调整 反应需要时间。

3）反应结束后确认扩增曲线及融解曲线， 进行标准曲线制作等。扩增产物特异性与否也可用琼脂糖凝胶电泳进行确认。  注意事项：

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前认真阅读 。 1）本品尽量避免反复冻融， 以免酶活下降。如每次使 用量少，推荐小份分装使用。

2）使用前上下颠倒以混匀， 请勿涡旋震荡以免产生气 泡 ，防止因混合不均匀造成反应液不足；产品经混匀后 轻微离心后即可使用。

3） 由于本品中含有荧光染料 SYBR Green Ⅰ,  无论保存 还是配制反应体系时都应该尽量避免强光照射。

4） 配制反应液时，试剂请于冰上放置。操作过程中， 一定使用新的（ 无污染的）枪头、反应管等，尽量避免 污染。

保存：

1、低温运输， 干冰运输更佳。

2 、-20℃ 避光保存，推荐使用期限为 6 个月。

3、短期使用可放在 4 ℃。 长期保存请置于-80℃,   勿 存于-20℃。

ROX 矫正染料：

ROX Reference Dye 最大吸收波长为 580nm，在 ABI 、Stratagene 等公司的 Real Time PCR 扩增仪上，可 用于矫正 PCR 加样误差以及管壁透光差异等因素引起 的光读取差异。不同仪器所需 ROX Reference Dye 浓度 不同。本产品根据客户要求，可提供 50×ROX 染料。

以下机器适用 ROX(H)，向 2×SG qPCR Mix 添加 1/50 后使用：

ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT Fast ； ABI  Step One；ABI Step One Plus。

以下机器适用 ROX(L) ， 向 2 × SG qPCR Mix 添加 1/500 后使用：

ABI 7500/7500 Fast； Stratagene Mx3000P/3005P/

4000；MJ Research Chromo4；Opticon(Ⅱ)；Corbett Rotor Gene3000。

以下机型不必添加 ROX 染料

Bio-Rad iQ5 ， CFX96 ， CFX384 ， Opticon ， Roch Lightcycler，Qiagen Rotor-Gene，Eppendorf Mastercycler， Cepheid SmartCycler

应用实例： 实验目的：

本实验利用 2×SG qPCR Mix 扩增大肠杆菌 DNA Poll 片段进行实时定量分析。

材料：

引物序列为：F-GCACTGGGCCCAGATTGAGAAAC， R-CGTAGATTTCGACGATACGG  ，  目   的 片 段 长 度  161bp。使用多种浓度大肠杆菌基因组为模板。

扩增反应：

M ，DNA Marker；Lane 1-5，扩增片段长度 161bp， 扩 增 模 板 采 用 大 肠 杆 菌 基 因 组 ， 使 用 量 分 别 为  500,250,100,50,25ng。Lane 6 为大肠杆菌模板的负对照。 反应结束后进行电泳分析， 上样量： 3µL/ 泳道 。 1%   agarose ， 1 ×TAE 。 电泳条件 6v/cm ，20min。