1.产品概述（Productoverview）

铁是生物体内含量最丰富的过渡金属元素之一，参与多种生理过程活动。近年来，研究者广泛关注活细胞内游离铁的存在，游离铁以稳定的氧化还原态形式存在，主要为亚铁离子（Fe2+）和铁离子（Fe3+）。在研究细胞内的还原环境、金属转运蛋白和Fe2+的水溶性等方面，了解Fe2+的机制比Fe3+更为重要。FerroOrange是一种新型荧光探针，可用于活细胞内Fe2+的荧光成像，但不适用于死细胞。FerroOrange与Fe2+反应后的荧光强度上升不可逆。可用荧光显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等进行检测。

Protocol(仅供参考):

1.1从冰箱取出FerroOrange，置于室温解冻，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。

1.2往一管FerroOrange(24μg)内加入35μLDMSO，用枪反复吹吸混匀，使其完全溶解制备1mMFerroOrange储存液。若单次不能用完储存液，请分装并置于-20℃避光保存，一个月内使用。

1.3于正式实验前，用中性缓冲液或无血清培养基来稀释1mMFerroOrange储存液到所需工作浓度(比如:1uM)，工作液需现配现用，尽快用完。【注意:酸性溶液会氧化FerroOrange，严重影响探针的效率】。

2.荧光显微镜操作方法

2.1.细胞接种于荧光培养皿中，在37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。

2.2.弃去上清液，并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。

2.3.更换含有药物的培养基，在37℃，5%CO2培养箱中孵育。*请根据药物特性优化孵育时间。

2.4.加入浓度为1μM的FerroOrange工作液，在37℃，5%CO2培养箱中孵育30分钟。*加入FerroOrange染色剂后直接观察，不要洗涤。

2.5.在荧光显微镜下观察细胞。

3.流式细胞仪操作方法

3.1将1x105个HeLa细胞（MEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）接种到6孔板中，并在37℃、5%CO2孵育箱中培养过夜。

3.2用无血清培养基（2mL）三次洗涤细胞。

3.3向对照组细胞中加入无血清培养基（1mL），硫酸铵亚铁处理组加入10mM的硫酸铵亚铁（10μL）（最终浓度：100μM）的无血清培养基。

3.4在37℃孵育箱中孵育细胞20分钟，并用HBSS（1mL）三次洗涤细胞

3.5经胰蛋白酶消化（250μL）后，用含血清的培养基（1mL）停止反应，将1.25毫升的细胞悬液转移到微离心管中。

3.6将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟。

3.7丢弃上清液，并向微离心管中加入HBSS（1mL），通过振荡混合。

3.8将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟，并丢弃上清液。

3.9向细胞中加入1μM的FerroOrange和无血清培养基的MEM（300μL）。

3.10在37℃孵育箱中孵育细胞15-30分钟。

3.11染色细胞经过细胞过滤器过滤，并使用流式细胞仪分析样本。

4.荧光检测

4.1对于荧光显微镜:通用的G激发滤片比如Cv3检测用的滤片。

4.2对于激光显微镜和流式细胞仪:532nm，514nm或561nm激光器用于激发。实在没有，亦可用488nm激光器。发射波长为580nm。

5.荧光酶标仪操作方法

5.1进行组别设置

样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。

样品B：添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)的HeLa细胞。

样品C：添加铁(硫酸铵铁)的HeLa细胞。

5.2在96孔黑板(透明底)上接种100μlHeLa细胞悬液，使其达到10,000cells/well，在37℃5%CO2培养箱中过夜培养。

5.3样品C的细胞用MEM(不含FBS)100μl洗涤3次。

5.4向样品C中添加100μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS)(最终浓度:100μM)，在37℃5%CO2培养箱中

静置30分钟。5.5用100μlHBSS洗涤所有孔的细胞3次。

5.6向样品A和C中添加100μl的1μMFerroOrangeworkingsolution，向样品B中添加100μl含有FerroOrange(最终浓度:1μM)和Bpy(最终浓度:100μM)的HBSS溶液，在37℃5%CO2培养箱中培养30分钟。

5.7用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543nm,Em:580nm)。

2.应用领域(ApplicationFields)

活细胞内Fe2+的荧光成像，活细胞成像本品仅限于科研用途，请勿用于人体。

3.储存条件(StorageConditions)

-20℃避光，12个月；冰袋运输

声明：此产品仅用于科学研究，我们不为任何个人用途提供产品和服务

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