CAS#：3326-32-7

中文名：异硫氰酸荧光素

英文名：Flourescein iso-thiocyanate

结构式：

分子式：C21H11NO5S

分子量：389.38

性质：

1. 外观：黄色粉末

2. 纯度：≥95% (HPLC)

3. 产品描述：

FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。

4. FITC标记抗体流程：

（1）  将待交联的蛋白（浓度³1mg/mL）对交联反应液透析三次4℃，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。

（2）  将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。

（3）  按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8h。

（4）  加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2h。

（5）  将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。

（6）  交联物的鉴定

蛋白浓度(mg/mL) = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4

F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，该值应介于2.5～6.5之间。

（7）  FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。

储存条件：

-20℃干燥避光保存，有效期一年。

加入1mL JC-10染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

在孵育期间，按照每1mL JC-10染色缓冲液（5×）加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-10染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。

37℃孵育结束后， 吸除上清，用JC-10染色缓冲液（1×）洗涤2次。

加入2mL细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

1.对于纯化的线粒体

把配制好的JC-10染色工作液再用JC-10染色缓冲液（1×）稀释5倍。

0.9mL 5倍稀释的JC-10染色工作液中加入0.1mL总蛋白量为10～100μg纯化的线粒体。

用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan），激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。

用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

2.荧光观测和结果分析

检测JC-10单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-10聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-10单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-10聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

保存条件：

-20℃避光保存，尽量避免反复冻融，有效期一年。

超纯水和JC-10染色缓冲液（5×）也可4℃保存。

注意事项：

1.    JC-10（200×）在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2.    必须先把JC-10（200×）用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后，才可以加入JC-10染色缓冲液（5×）。不可先配制JC-10染色缓冲液（1×）再加入JC-10（200×），这样JC-10会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。

3.    装载完JC-10后用JC-10染色缓冲液（1×）洗涤时，使JC-10染色缓冲液（1×）保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。

4.    JC-10探针装载完并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

5.    请勿把JC-10染色缓冲液（5×）全部配制成JC-10染色缓冲液（1×），本试剂盒使用过程中需直接使用JC-10染色缓冲液（5×）。

6.    如果发现JC-10染色缓冲液（5×）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。

7.    CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。

8.    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。