l  货号及规格

l  产品介绍

Fluo-4, AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内，Fluo-4若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

l  操作说明（for Human T cells）*

（1） 试剂

5 mM的Fluo-4, AM/DMSO

Pluronic F127

Hanks•balanced salt solution（HBSS）

HEPES buffer saline（10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4）

（2） 操作

①. 向Fluo-4, AM/DMSO溶液中加入16.5mg Pluronic F127，Pluronic F127可以防止Fluo-4, AM在HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。

②. 用HBSS稀释Fluo-4, AM溶液，制备4-5µM的Fluo-4, AM工作液。

③. 将Fluo-4, AM工作液加入细胞，在37℃培养20分钟。

④. 加入5倍体积的含有1%胎牛血清的HBSS，再继续培养40分钟。

⑤. 用HEPES buffer saline洗涤细胞3次，然后用HEPES buffer saline使细胞重悬浮，制成1×105 cells/mL的溶液。

⑥. 37℃下培养10分钟，然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长494nm，发射波长516nm。

*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。

l  其他说明

Fluo 4是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。

由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似(Fluo 3:Kd=0.4 μmol/l、Fluo 4: Kd=0.36 μmol/l)，所以使用上和Fluo 3也基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等仪器检测细胞内钙离子浓度的变化。

Fluo 4-AM是Fluo 4的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo 4随后会和钙离子(Ca2+)结合并发出荧光。钙离子探针、胞内荧光探针的种类繁多，根据不同的实验要求，实验者的选择性有很多。

Fluo 4-AM (钙离子荧光探针) 需用无水DMSO (anhydrous DMSO)配制。Fluo 4-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo 4-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 4，从而被滞留在细胞内。

l  储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。